بایگانی دسته بندی ها: تست مولکولار

از تست مولکولار (مولکولی) و آزمایش آنتی ژن برای تشخیص عفونت های فعال و به خصوص عفونت فعال ویروس SARS-CoV-2 استفاده می شود.

آزمایش های تشخیصی می توانند مبتنی بر آنتی ژن باشند (آزمایشات “آنتی ژن سریع”) که به دنبال مارکرهای پروتئینی در خارج ویروس هستند ، یا می توانند مبتنی بر مولکولی باشند (از جمله PCR ، LAMP ، CRISPR) ، که به دنبال ماده ژنومی ویروسی خاص مانند SARS-CoV-2 هستند.

به آزمایش های مبتنی بر مولکولی که ماده ژنتیکی را تقویت می کنند ، آزمایش های تقویت اسید نوکلئیک (NAAT) نیز می گویند.

    به دنبال عفونت فعال SARS-CoV-2 باشید:

•         شناسایی قسمتهای خاصی از توالی ژن SARS-CoV-2
•         شناسایی مارکرهای خاص در خارج از ویروس SARS-CoV-2

تست های تشخیصی مولکولی و آنتی ژن

---

•     تست مولکولار (مولکولی) و آزمایش آنتی ژن چگونه کار می کنند؟

•     چه مواردی برای انجام آزمایش آنتی ژن یا مولکولی لازم است؟

•     آزمایش های مولکولی چگونه SARS-CoV-2 را تشخیص می دهند؟

•     چند نوع تست مولکولار (مولکولی) و آزمایش آنتی ژن در بازار وجود دارد؟ چه تفاوتی بین آنها وجود دارد؟

---

تست مولکولار (مولکولی) و آزمایش آنتی ژن چگونه کار می کنند؟

ویروس ها برای تکثیر به میزبان احتیاج دارند. این ویروس‌ها سلول‌های میزبان را ربوده تا نسخه های ویروسی بیشتری از خودش تولید کند.

ماده ژنومی ویروس SARS-CoV-2 اسید ریبونوکلئیک (RNA) است که در بدن باقی می ماند در حالی که ویروس هنوز تکثیر و تولید مثل می شود.

آزمایش های تشخیصی به دنبال شواهدی از این روند همانند سازی – وجود ویروس های بیشتر – برای تشخیص عفونت فعال COVID-19 است.

آزمایش های تشخیصی آنتی ژن ، ویژگی های ساختاری خارج ویروس به نام آنتی ژن ها را شناسایی می کند – پروتئین های کوچکی که ویروس را تشکیل می دهند – که ممکن است در نمونه بیمار وجود داشته باشد.

آزمایشات تشخیصی آنتی ژن برای:

• یافتن شواهد بزرگتر مبنی بر اینکه ویروس SARS-CoV-2 به طور فعال شخصی را آلوده می‌کند
• شناسایی آنتی ژن های 3 بعدی خاص در خارج از ویروس SARS-CoV-2

آزمایش های مولکولار (مولکولی) بیت های RNA ویروسی را تقویت می کنند تا عفونت ویروسی با استفاده از یک آزمایش تخصصی تشخیص داده شود.

از این آزمایشات به عنوان تست‌های تقویت اسید نوکلئیک (NAAT) نیز یاد می‌شود. این روش با گرفتن نمونه از بینی یا دهان فرد بالقوه آلوده (بزاق) ، جایی که ممکن است ویروس پیدا شود ، آغاز می‌شود.

اگر ویروس کرونا SARS-CoV-2 در نمونه وجود داشته باشد ، حتی می توان سطح کمی از ماده ژنومیک ویروس را به میلیون ها نسخه شناسایی شده در طی یک آزمایش تشخیصی مولکولی ، تکثیر کرد.

اگر فردی آلوده باشد ، RNA ویروسی شناسایی و نتیجه آزمایش مثبت ایجاد می‌کند.

اگر فردی آلوده نباشد ، هیچ RNA ویروسی کپی یا شناسایی نمی‌شود ، که نتیجه آزمایش منفی ایجاد می‌کند.

تقویت سیگنال امکان شناسایی حتی مقدار کمی ویروس را فراهم می‌کند. این دسته از آزمایش های تشخیصی شامل تست‌های واکنش زنجیره ای پلیمراز (تست PCR) ، تقویت ایزوترمال با واسطه حلقه (LAMP) و آزمایش‌های مبتنی بر تکرار کوتاه پالیندرومیک خوشه ای و منظم با هم فشرده (CRISPR) است.

---

این مطلب را بخوانید: تست PCR کرونا

---

طیف گسترده ای از تشخیص‌های مولکولی وجود دارد و برخی نتایج سرعتی تر از روش‌های مبتنی بر PCR دارند.

این آزمایشات سریع مولکولی شامل LAMP است که می تواند نتایج را در عرض چند دقیقه و نه ساعت ارائه دهد.

آزمایش‌های سریع مولکولی که از تکنیک‌هایی مانند LAMP استفاده می‌کنند بسیار خاص هستند ، اما همچنین بسیار حساس هستند زیرا مواد ژنومی را در نمونه بیمار تقویت می‌کنند.

نکته مهم ، همه آزمایش های تشخیص سریع آزمایش آنتی ژن نیستند – برخی از آنها آزمایش‌های سریع مولکولی هستند که بسیار حساس بوده اما در عرض چند دقیقه نتیجه می‌دهند.

آزمایش های تشخیصی مولکولی یا تست مولکولار برای:

• تشخیص اینکه ویروس SARS-CoV-2 به طور فعال یک فرد را آلوده می کند
• ایجاد میلیونها نسخه از بخشهای کوچک ویروس SARS-CoV-2 ، در صورت وجود در نمونه بیمار ، تقویت سیگنال
• شناسایی آن میلیون ها نسخه در ماشین های تخصصی

---

چه مواردی برای انجام آزمایش آنتی ژن یا تست مولکولار لازم است؟

آزمایش های آنتی ژن و مولکولی به نمونه هایی – مانند سلول های سطح نازوفارنکس یا خلط / بزاق – نیاز دارد که احتمالاً حاوی ویروس هستند.

ویروس ها و سایر عوامل بیماری زا نیز ممکن است در مدفوع ، ادرار یا خون تشخیص داده شوند. برای بیماری‌های تنفسی مانند کرونا COVID-19 ، بیشتر آزمایشات موجود یا در حال تکامل از نمونه های بینی فرد (با استفاده از سواب های حلق یا حلزون یا سواب های جلوی بینی) یا دهان (با استفاده از لیوان های جمع آوری بزاق) استفاده می‌کنند.

بیشتر آزمایشات مولکولی به دلیل پیچیدگی و حساسیت فرآیند آزمایش در محیط آزمایشگاهی انجام می‌شود.

نتیجه برخی از تست‌های مولکولار آزمایشگاهی ممکن است 1 روز یا بیشتر طول بکشد.

برخی از آزمایشات ، از جمله بسیاری از آزمایشات آنتی ژن ، مجاز به استفاده در محل مراقبت هستند ، به این معنی که می‌توان آنها را در یک محیط پزشکی انجام داد و نتایج را می توان در حدود 30 دقیقه در دسترس قرار داد.

تست مولکولار (مولکولی) و آزمایش آنتی ژن:

• بسته به نوع آزمون مورد استفاده ، می تواند از چند دقیقه تا چند روز به نتیجه برسد
• می تواند در تنظیمات مختلفی (خانه ، مطب ارائه دهنده خدمات بهداشتی یا آزمایشگاه) انجام شود

---

آزمایش های مولکولی چگونه SARS-CoV-2 را تشخیص می دهند؟

بیشتر آزمایش های مولکولی برای SARS-CoV-2 از روند واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی ترانس کریپتاز معکوس در زمان واقعی (rRT-PCR) استفاده می‌کنند.

در کل ، اکثر کیت های مولکولی با عنوان rRT-PCR برچسب گذاری شده‌اند. آزمایشات ذکر شده به عنوان تولید کنندگان آنها نام برده شده است ، اگرچه در بعضی موارد از qPCR استفاده می‌کنند.

اگر آزمایشی اطلاعات کمی و نه صرفاً کیفی (بله / خیر) را فراهم کند ، این علاوه بر PCR به PCR کمی (q) نیز نیاز دارد.

این آزمایش‌ها به مراحل زیرمتکی هستند:

• مواد ژنتیکی (DNA یا RNA) خاص پاتوژن را تشخیص دهد
• ناحیه شناسایی شده از ماده ژنتیکی عامل بیماری زا را تقویت کند (نسخه های بیشتری از آن تهیه کنید)
• اندازه گیری خروجی از مقدار ماده ژنتیکی تقویت شده را تولید کند ، اگر در نمونه وجود داشته باشد

در مرحله 1 ، محققان قطعات کوچکی از DNA تک رشته ای را به نام “آغازگرها” طراحی می کنند که دقیقاً با یک منطقه خاص از ژنوم ویروسی مطابقت دارند.

آغازگرها سپس به نواحی خاصی از ژنوم ویروسی متصل یا “آنیل” می شوند و ستون فقرات را برای تقویت آن منطقه فراهم می‌کنند.

هنگام ساخت آغازگرها ، محققان به دنبال قسمتهای خاصی از ژنوم ویروسی هستند که فقط مختص ویروس مورد بحث باشد. از آنجا که RNA ویروسی برای تجسم و شناسایی در مقادیر بسیار کمی بسیار کوچک است ، برای تقویت سیگنال لازم است.

برای بیشتر ژنومهای مبتنی بر RNA ویروسی ، مرحله دیگری به نام رونویسی معکوس مورد نیاز است.

ژنوم SARS-CoV-2 از RNA ساخته شده است که نسبت به DNA از پایداری کمتری برخوردار است و نسبت به اشعه ماورا بنفش و تجزیه آنزیم ها حساسیت بیشتری دارد.

 بنابراین ، استخراج RNA و استفاده در آزمایش باید با دقت انجام شود تا مواد ژنتیکی حفظ شود.

 رونویسی معکوس از پروتئین‌هایی به نام آنزیم‌های معکوس ترانس کریپتاز برای ترجمه RNA به DNA استفاده می‌کند ، مولکولی با ثبات تر.

در مرحله 2 ، ناحیه ای که آغازگرها به آن متصل می شوند یا آنیل می‌شوند ، در چرخه‌های تکراری تقویت می‌شود. این چرخه ها به منظور تقلید نزدیک از فرایندهای تکثیر DNA طبیعی در تمام سلول‌های انسانی طراحی شده اند.

در بیشتر تست های PCR ، چرخه های تقویت به تغییرات دما برنامه ریزی شده متکی هستند که DNA دو رشته را تقسیم می‌کند ، به آنزیم های تکثیر اجازه می‌دهد نسخه جدیدی از DNA ایجاد کنند و سپس رشته‌های تازه تشکیل شده را دوباره به هم ببندند.

به همین دلیل ، بیشتر تست‌های PCR باید در دستگاه‌هایی موسوم به “ترموسیکلرها” انجام شود ، که امکان تنظیم زمان چرخه ، دما و تعداد تکرارها را فراهم می‌کند.

استثنا در این فرآیند روش‌های همدما است ، مانند تقویت هم دما در حلقه (LAMP) ، که برای تقویت DNA هدف نیازی به چرخه‌های گرمایش نیست.

مرحله 2 تا زمانی ادامه می یابد که محققان به اندازه کافی مواد ژنتیکی را برای توانایی خواندن آنها ترکیب نکردند.

در مرحله 3 ، خروجی حاصل از فرآیند تقویت مورد مطالعه قرار می گیرد و محققان می توانند ویروس را در داخل نمونه تجسم کنند.

در ماشین های RT-qPCR در زمان واقعی ، خروجی قابل خواندن به صورت فلورسانس نشان داده می شود که ماده تقویت شده با افزایش مقدار آن پس از چرخه های تقویت چندگانه ، از آن خارج می شود.

گرچه همه آزمایشات ذکر شده در زیر آزمایش rRT-qPCR نیستند ، اما همه آزمایشات مولکولی برای آگاهی محققان از وجود پاتوژن ، یا با شناسایی مواد ژنتیکی آن یا شناسایی نشانگرهای منحصر به فرد خود پاتوژن ، ساخته شده اند.

یک مرحله تقویت برای این آزمایش ها بسیار مهم است زیرا در غیر این صورت محققان قادر نیستند به راحتی و به سرعت حضور چنین مولکول های کوچکی را تشخیص دهند.

---

چند نوع تست مولکولار (مولکولی) و آزمایش آنتی ژن در بازار وجود دارد؟ چه تفاوتی بین آنها وجود دارد؟

در حال حاضر پنج نوع آزمایش آنتی ژن و مولکولی در دسترس است:

نوع آزمایش	زمان نتیجه	آنچه به ما می گوید	محدودیت ها
تست آنتی ژن سریع (RAT)	15-30 دقیقه	وجود یک عفونت فعال ، با شناسایی پروتئین های ویروسی خاص موجود در یک نمونه بیمار. این به طور معمول با روش های جریان جانبی همراه است تا نتایجی را که می توان با چشم خواند نمایش داد.	نیاز به طراحی بسیار دقیق آنتی بادی های مصنوعی ، شناخت عمیق پروتئین های ویروسی تولید شده در محیط های مختلف بافتی دارد و در صورت کم بودن تولید پروتئین ویروسی ممکن است منفی کاذب ایجاد کند.
rRT-qPCR	2-4 ساعت	وجود یک عفونت فعال ، با هدف قرار دادن توالی ژنی خاص SARS-CoV-2. این می تواند کمی باشد اما معمولاً کیفی است (بله / خیر). به طور معمول محدودیت بسیار کمی در تشخیص دارد ، حدود 100 ویروس در میلی لیتر.	زمان لازم برای تکمیل آزمون. پرسنل آموزش دیده و تجهیزات ویژه برای تجزیه و تحلیل نتایج
LAMP	15-60 دقیقه	وجود یک عفونت فعال ، با هدف قرار دادن توالی ژنی خاص SARS-CoV-2. این نوعاً کیفی است (بله / خیر). این تکیه بر آغازگرهای ویژه طراحی شده است که به ایجاد ساختارهای حلقه ای مورد نیاز برای تقویت کمک می کند. بسیار سریع است و همیشه به تجهیزات خاصی احتیاج ندارد (در بعضی موارد با چشم قابل اندازه گیری است). حد تشخیص 125 ویروس در میلی لیتر بسیار کم است.	طراحی آغازگرهای مورد نیاز می تواند پیچیده باشد و باقی مانده ها می توانند در واکنش دخالت کنند. همچنین کمی سازی نتایج (سطح عفونت ویروسی) دشوار است.
RPA	15-60 دقیقه	وجود یک عفونت فعال ، با هدف قرار دادن توالی ژنی خاص SARS-CoV-2. این نوعاً کیفی است (بله / خیر). متکی به آنزیم recombinase است. بسیار سریع است و همیشه به تجهیزات خاصی نیاز ندارد. حد تشخیص 125 ویروس در میلی لیتر بسیار کم است.	طراحی آغازگرهای لازم می تواند پیچیده باشد و باقی مانده ها می توانند واکنش را مختل کنند. همچنین کمی سازی نتایج (سطح عفونت ویروسی) دشوار است.
تشخیص مبتنی بر CRISPR	15-60 دقیقه	وجود یک عفونت فعال ، با هدف قرار دادن توالی ژنی خاص SARS-CoV-2. این به طور معمول با LAMP همراه است ، اما این همیشه لازم نیست. نتایج به طور معمول برای چشم قابل مشاهده است و نیازی به تجهیزات خاصی ندارد.	نیاز به تخصص ، طراحی خاص اجزای سازنده (آنزیم ها ، آغازگرها ، گزارشگران) دارد.