شناسایی و تشخیص انگل های خونی از وظایف مهم آزمایشگاه ها به شمار می‏ آید. در این میان تشخیص مالاریا به علت شیوع بیشتر در ایران و همچنین ایجاد عوارض شدید و گاهاً مرگ، در صورت عدم تشخیص و درمان به موقع، از اهمیت بسزایی برخوردار است.

اگر چه بیماری در نواحی شرقی وجنوب شرقی ایران خصوصا در مناطق غیر شهری شیوع بیشتری دارد ولی کلیه آزمایشگاه ها می‏بایست در هر زمان آمادگی پذیرش و تشخیص نمونه مشکوک به این بیماری را داشته باشند.

با وجود پیشرفت آزمایشات تشخیصی و حتی دستیابی به روشهای دقیق جهت شناسایی آنتی ژن انگل ها، کماکان روش تشخیصی قطعی بسیاری از انگل های خونی از جمله پلاسمودیومها مشاهده آنها در گسترش خونی می باشد.  از آزمایشاتی نظیر یافتن آنتی ‏بادی‏های ضد انگل مالاریا نیز می توان در برنامه‏های غربالگری و یا شناسایی خون‏های آلوده در دهندگان خون استفاده ‏نمود. تهیه گسترشهای خونی در بیماری های بابزیازیس، مرحله حاد شاگاس، تریپانوزومیاز آفریقایی وبعضی ازانواع فیلاریازیس نیز قدم اولیه ومهم جهت تشخیص می باشد.

بنابراین با توجه به اهمیت تشخیصی گسترش‏های خونی، کلیه کارکنان آزمایشگاه ها می‏بایست از روش‏های صحیح جمع آوری نمونه و تهیه گسترش‏های خونی، تهیه رنگ و بافرهای لازم، رنگ‏آمیزی مناسب و در نهایت ویژگی‏های مرفولوژیکی انگل ها آگاه باشند.

جمع‏ آوری نمونه خون برای تشخیص مالاریا

اگر چه به محض شک به مالاریا در هر زمان جمع آوری نمونه الزامی است ولی رعایت زمان خونگیری، شناسایی گونه و مرحله زندگی انگل را امکان پذیرتر می سازد. بهترین زمان خونگیری در فواصل بین حملات لرز و قبل از شروع تب می‏باشد و معمولابه دلیل عدم امکان یافتن انگل در یک نوبت خونگیری، جمع‏آوری خون و تهیه گسترش می بایست تا سه روز متوالی هر ۶-۸ ساعت ادامه یابد. بدیهی است که تهیه نمونه قبل از استفاده از هرگونه داروی ضد مالاریا دارای ارزش تشخیصی می باشد.

تهیه نمونه خون از طریق خونگیری مویرگی و وریدی امکان پذیرمی باشد، ولی استفاده از خون مویرگی ارجح است، زیرا مواد ضد انعقاد موجب تغییرات مرفولوژیکی در انگل شده بنا بر این استفاده ازخون وریدی محدود به شرایطی است که تهیه گسترش‏های مناسب با استفاده از خون مویرگی مسیر نباشد.در اینگونه موارد استفاده ازضد انعقادEDTA با رعایت نسبت دقیق با خون توصیه می گردد. در صورت عدم رعایت این نسبت امکان شسته شدن گسترش ضخیم از روی اسلاید هنگام رنگ‏آمیزی و یا عدم رنگ‏پذیری مناسب انگل وجود دارد. در هر حال در موارد خونگیری وریدی بهتر است تهیه گسترش از خون داخل سرنگ و قبل از مخلوط شدن با ماده ضد انعقاد و در صورت عدم امکان حداکثر ۱ ساعت پس از نمونه‏گیری صورت گیرد. با گذشت یک ساعت از زمان نمونه گیری، تغییرات مرفولوژیکی در ساختمان انگل ایجاد شده و حالت منقوط شدن گلبول‏های قرمز نیز از بین می‏رود ولی شکل کلی انگل حداکثر تا دو ساعت قابل تشخیص باقی می‏ماند.
تهیه گسترش های خونی مالاریا

جهت تشخیص انگل از گسترش های ضخیم و نازک استفاده شده و طبق توصیه CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) در زمان پذیرش بیمار تهیه حداقل ۴ گسترش خونی شامل دو گسترش ضخیم و دو گسترش نازک ضروری می باشد.

گسترش‏های ضخیم امکان تشخیص عفونت‏های خفیف را فراهم ساخته و در واقع حجم زیادی از خون در زمان کمی بررسی می گردد، اگرچه تشخیص گونه پلاسمودیوم‎ در این نوع گسترش ها به مهارت کافی نیاز دارد.

با بررسی گسترش‏های خونی نازک امکان تشخیص مراحل مختلف زندگی انگل و افتراق گونه‏های مختلف فراهم می گردد.

طرز تهیه گسترش های خونی نازک همانند تهیه گسترش‏های خونی معمول بوده که در آزمایشگاه ها به منظور بررسی سلولهای خونی انجام می گردد. یک گسترش نازک مناسب می‏بایست در ناحیه مرکزی اسلاید واقع شده، حاشیه‏های کناری آن آزاد، در یک انتها ضخیم و در انتهای دیگر نازک و طول قسمت نازک آن حداقل ۲ سانتی‏متر باشد.  این گسترش‏ها در دمای اتاق خشک شده و پس از خشک شدن می بایست با متانول خالص ثابت ‏گردند.

تهیه گسترشهای ضخیم به دو صورت امکان پذیر می‏باشد:

در روش اول می‏توان پس از تماس اسلاید با قطره خون حاصل از خونگیری مویرگی با چرخاندن اسلاید (یا با استفاده از انتهای سواپ) خون را پخش کرده تا به قطر و ضخامت مناسب برسد (قطر سکه دو ریالی و ضخامتی که نوشته‏های روزنامه از پشت آن براحتی قابل خواندن نباشد.) در صورت بزرگ نبودن قطره خون و یا لخته شدن آن استفاده از این روش مناسب نمی‏باشد.

گسترش‏های ضخیم می‏بایست در سطح صاف افقی و دمای اتاق خشک شده ولی ثابت نگردند. در مناطق مرطوب می‏توان از انکوباتور Cْ۲۵ برای خشک کردن گسترشها استفاده نمود ولی استفاده از دمای  Cْ۳۷ و یا حرارت به دلیل ثابت شدن گلبول‏های قرمز و عدم لیز کامل آنها توصیه نمی‏ گردد. این گسترش‏ها در دمای اتاق در عرض ۱۲-۸ ساعت خشک می‏شوند ولی با استفاده از پنکه می‏توان این زمان را به حدود ۴-۱ ساعت تقلیل داد. در موارد اضطراری جهت تشخیص سریع می‏توان گسترش‏ها ضخیم را اندکی نازکتر از معمول تهیه نمود تا در عرض یک ساعت خشک شوند.

در بعضی از آزمایشگاه ها خون حاوی EDTA سانتریفوژ شده و پس از برداشتن پلاسما و بافی کوت، از لایه‏های فوقانی گلبول‏های قرمز و پلاسمای باقیمانده گسترش نازک تهیه می‏گردد. این روش باعث تغلیظ انگل ها و همچنین کاهش تعداد پلاکتها در گسترش می شود. کاهش پلاکتها امکان ایجاد خطاهای تشخیصی را کاهش می دهد. گسترش‏های تهیه شده قبل از رنگ‏آمیزی می‏بایست با متانول خالص ثابت شوند.

رنگ‏ آمیزی گسترش‏های خونی برای مالاریا

گیمسا مناسب‏ترین رنگ جهت رنگ‏آمیزی انگل های خونی می‏باشد و امکان تشخیص دانه‏های شافنر،که در بعضی از گونه‏های پلاسمودیوم دیده می‏شود، را میسر می‏سازد. این دانه ها در رنگ‏آمیزی‏های رایت یا رایت گیمسا بخوبی قابل تشخیص نمی‏باشند. نکته مهم در تهیه رنگ، تنظیم PH بافر رقیق‏کننده( بافر فسفات) بوده که جهت تشخیص افتراقی انواع انگل های خونی می‏بایست در حد ۲/۷-۷ حفظ شود. از رنگ گیمسا با غلظت‏های مختلف می‏توان جهت رنگ آمیزی گسترش ها متناسب با شرایط بیمار و به منظور تشخیص سریع استفاده نمود بطور مثال در موارد اضطراری استفاده از رنگ با غلظت ۵/۷% به مدت ۱۵ دقیقه و در سایر موارد به منظور رنگ‏آمیزی بهتر ساختمان‏های داخلی انگل استفاده از غلظت‏های ۵/۲% به مدت ۴۵ دقیقه و یا ۲% به مدت ۶۰ دقیقه توصیه می گردد. در پایان رنگ آمیزی، شستشوی اسلایدها با بافر دارای PH 2/7-7 کیفیت نهایی رنگ را بهتر می‏نماید.

کنترل کیفی رنگ و بررسی کیفیت رنگ پذیری انگل ها با استفاده از رنگ‏آمیزی گسترش‏های خونی معمولی امکان پذیر می باشد که در صورت مناسب بودن رنگ پذیری گلبول‏های قرمز، سفید و پلاکت‏ها، می توان از رنگ‏آمیزی مناسب انگل ها نیز مطمئن گردید.

برای آگاهی از طرز تهیه رنگ و بافر رقیق کننده می توان از کتب مرجع یا دستورالعمل استاندارد CLSI(M15-A) استفاده نمود.

بررسی گسترش‏های خونی تهیه شده جهت تشخیص مالاریا

بطور کلی در بررسی گسترش‏های خونی جهت شناسایی و تشخیص انگل ها ابتدا از درشتنمایی کم و متوسط (×۱۰و ×۴۰) میکروسکوپ جهت یافتن اجزا درشت‏تر نظیر شیزونت و گامتوسیت و نهایتاً از درشت نمایی زیاد (×۱۰۰) جهت بررسی کامل گسترش استفاده می‏گردد. برای بررسی کامل گسترش می بایست حداقل ۳۰۰ میدان با درشتنمایی زیاد (× ۱۰۰ ) مشاهده گردد.

تشخیص انگل های خونی، خصوصاً چهارگونه پلاسمودیوم‏ که در انسان ایجاد عفونت نموده و همچنین افتراق صحیح آنها از هم جهت انتخاب درمان مناسب ضروری است. افتراق این گونه‏ها با استفاده از مشخصاتی نظیر اندازه و شکل گلبول‏های قرمز آلوده، وجود یا عدم وجود

دانه‏ های شافنر، شکل و تعداد تروفوزوئیتها در داخل گلبول قرمز و شکل گامتوسیت‏ها امکان پذیر بوده که معمولاً تشخیص قطعی با استفاده از کنار هم قرار دادن چند یافته فوق امکان پذیر می گردد.

نکته مهم در امر تشخیص، افتراق انگل از مواردی مانند پلاکت‏، رسوب رنگ، قارچ و یا باکتریهایی است که بر روی گلبول قرمز قرار گرفته‏اند. افتراق پلاسمودیوم فالسی پاروم از بابز یا نیز جهت انتخاب درمان مناسب، دارای اهمیت بوده که اگرچه این امر گاهاً در بررسی میکروسکوپی به سختی صورت گرفته، به دلیل عدم دسترسی تمامی آزمایشگاه ها به آزمایشهای اختصاصی نظیر تلقیح نمونه مشکوک به حیوانات آزمایشگاهی، آزمایشات سرولوژی و یا PCR کماکان تشخیص افتراقی میکروسکوپی از اهمیت ویژه‏ای برخوردار می‏باشد.

تعیین میزان پارازیتمی

تعیین میزان پارازیتمی قبل از شروع درمان و جهت پیگیری اثر دارو بر روی عفونت و تعیین سوشهای مقاوم به داروی پلاسمودیوم فالسی پاروم ضروری می‏باشد که بطور معمول قبل از درمان و ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت پس از درمان انجام می‏گیرد. در صورت موفقیت درمان میزان پارازیتمی در عرض ۲۴ ساعت اول درمان بطور مشخص کاهش می‏یابد. ( تا ۵۰% یا بیشتر )

تعیین میزان پارازیتمی به دو روش امکان پذیر می باشد.در روش اول که فقط در گسترش‏های نازک قابل انجام بوده با حداقل مشاهده ۱۰ میدان میکروسکوپی درصد گلبول‏های قرمز آلوده به ازای شمارش۱۰۰ گلبول‏ قرمز گزارش می‏گردد. (مثلاً ۰۵/۰% یا ۱%)

در مواردی که تعداد انگل ها در خون کم است می توان از روش دیگری استفاده نمود که بر روی هر دو گسترش‏ ضخیم و نازک قابل انجام است. در این روش تعداد انگل برحسب شمارش ۱۰۰ گلبول‏ سفید اعلام می‏گردد. همچنین می‏توان مقدار انگل را در یک میکرولیتر خون نیز محاسبه نمود که برای اینکار تعداد انگل شمرده شده بر حسب ۱۰۰ گلبول‏ سفید در تعداد کل گلبول‏های سفید خون ضرب شده و نتیجه بر عدد ۱۰۰ تقسیم می‏گردد. قابل ذکر است که در صورت کم بودن تعداد انگل ها می‏توان تعداد آنها را به ازای ۲۰۰ گلبول‏ سفید شمارش نمود.